對于種雞來說，必須在飼料中添加充足的維生素D3，以便使蛋黃中能夠沉積足夠水平的鈣三醇，從而滿足胚胎鈣代謝的額外需要。維生素D3的最低添加率旨在滿足雞的需要量從而避免雛雞和成年母雞發(fā)生鈣化不良，最高添加率旨在滿足快速生長肉雞品系的需要，以及滿足對“弱腿癥”遺傳性敏感的肉雞品系的需要。因此，飼料中維生素D3的含量必需嚴格控制。

賽智科技參考國標（GB/T 17818-2010），利用全新高性能的LC-10Tvp高效液相色譜儀，經(jīng)實踐檢測可提供飼料中維生素D3的HPLC檢測方案，得出的結(jié)果準確可靠，檢出限好，適用于配合飼料、濃縮飼料、復(fù)合預(yù)混合飼料、維生素預(yù)混合飼料中維生素D3的測定，僅供廣大用戶參考。

以下是維生素D3的液相(HPLC)測定的詳細檢測方法。

1　 儀器與試劑

1.1 儀器
　　LC-10Tvp高效液相色譜儀；
　　Vertex 色譜柱：150mm×4.6mm×5μm ；
　　分析天平，感量為分別為0.001g，0.0001g，0.00001g；
　　圓底燒瓶，帶回流冷凝器；
　　恒溫水浴鍋；
　　旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；
　　超純水器。

1.2 試劑
　　無水乙醚：不含過氧化物；
　　無水乙醇；
　　正己烷，色譜純；
　　1,4二氧六環(huán)；
　　甲醇，色譜純；
　　2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）；
　　無水硫酸鈉；
　　氮氣（純度99%）；
　　碘化鉀溶液；
　　淀粉指示液；
　　硫代硫酸鈉溶液；
　　氫氧化鉀溶液；
　　L-抗壞血酸純品；
　　酚酞指示劑；
　　氯化鈉；
　　維生素D3乙酸酯標準品：含量≥99%。

2　 檢測原理
　　用堿溶液皂化試樣，乙醚提取維生素D3，蒸發(fā)乙醚，殘渣溶解于甲醇并將部分溶液注入高效液相色譜反相凈化柱，收集含維生素D3淋洗液，蒸發(fā)至干，溶解于適當(dāng)溶劑中，注入高效液相色譜分析柱，在264nm處測定，外標法定量。

3　 試樣溶液的制備

3.1 皂化
　　稱取試樣適量，置入圓底燒瓶中，加L-壞血酸乙醇溶液，使試樣完全分散、浸濕，加氫氧化鉀溶液，混勻，置于沸水浴上回流，不時震蕩防止試樣粘附在瓶壁上，皂化結(jié)束，分別用無水乙醇、水自冷凝管頂端沖洗其內(nèi)部，取出燒瓶冷卻至約40℃。

3.2 提取
　　定量轉(zhuǎn)移全部皂化液于盛有無水乙醚的分液漏斗中，用蒸餾水分2次~3次沖洗圓底燒瓶并入分液漏斗，加蓋、放氣，隨后混合，激烈震蕩，靜置分層。轉(zhuǎn)移水相于第二個分液漏斗中，分次用乙醚重復(fù)提取兩次，棄去水相，合并三次乙醚相。用氯化鈉溶液洗滌一次，再用蒸餾水多次洗滌乙醚提取液至中性，初次水洗時輕輕旋搖，防止乳化。乙醚提取液通過無水硫酸鈉脫水，轉(zhuǎn)移到棕色容量瓶中，加BHT使之溶解，用乙醚定容至刻度。以上操作均在避光通風(fēng)柜內(nèi)進行。

3.3 濃縮
　　從乙醚提取液中分取一定體積置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器燒瓶中，在水浴溫度約50℃，部分真空條件下蒸發(fā)至干或用氮氣吹干。殘渣用甲醇溶解并稀釋，離心或通過0.45μm過濾膜過濾，收集清液移入小試管，用于高效液相色譜儀分析。以上操作均在避光通風(fēng)柜內(nèi)進行。

3.4 高效液相色譜凈化柱凈化
　　用甲醇溶解圓底燒瓶中的殘渣，向高效液相色譜凈化柱注射甲醇溶液收集含維生素D3餾分于小容量瓶中，蒸發(fā)至干，溶解于正己烷中。
　　以下為高效液相色譜凈化條件：
　　色譜凈化柱：Lichrosorb RP-8，250mm×10mm×10μm；
　　流動相：甲醇+水=90+10；
　　流速：2.0mL/min；
　　溫度：室溫；
　　檢測波長：264nm。

4　 色譜條件
　　色譜柱：Vertex 色譜柱　150mm×4.6mm×5μm；
　　流動相：甲醇+水=95+5；
　　流速：1.0mL/min；
　　溫度：室溫；
　　進樣量：20μL。
　　檢測波長：264nm。

5　 維生素D3標準高效液相色譜圖